genTaq

El Laboratorio de Genética y Biología Molecular presenta con orgullo uno de los mayores avances de la biotecnología colombiana. Se trata de la producción de la genTaq Polimerasa, reactivo molecular que desde hace cinco años viene siendo perfeccionado hasta el punto de que hoy en día compite con el mismo reactivo de orígen americano o europeo. Está demostrado que la genTaq Polimerasa recombinante es idéntica a la ADN polimerasa natural de Thermus aquaticus, con respecto a actividad, especificidad, termoestabilidad, fidelidad y procesividad para amplificar ADN in vitro a través de la técnica PCR. La genTaq Polimerasa funciona correctamente en un rango de temperaturas de alineamiento desde 30°C hasta 72°C. Una unidad de la enzima cataliza la incorporación de 10nmol de DNTPs en 30 minutos a 72°C.

Descripción

 

La enzima genTaq Polimerasa tiene un peso molecular de 94 KDa y es producida a partir de la cepa de E.coli recombinante DH5α pTTQ TaqPol Thermus aquaticus. Está demostrado que la genTaq Polimerasa recombinante es idéntica a la ADN polimerasa natural de Thermus aquaticus, con respecto a actividad, especificidad, termoestabilidad, fidelidad y procesividad para amplificar ADN in vitro a través de la técnica PCR. La genTaq Polimerasa funciona correctamente en un rango de temperaturas de alineamiento desde 30°C hasta 72°C. genTaq ADN Polimerasa es un producto de alto rendimiento para PCR generando confianza en los resultados a obtener. Esta preparación de la enzima se suministra con componentes como el Buffer 10X, el potenciador de la reacción MgCl2, en concentraciones adecuadas, que elimina la necesidad de optimización del producto de amplificación.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD:
genTaq polimerasa debe ser almacenada a -20°C antes de su uso, una vez empiece a utilizarla almacene a 4°C. Los ciclos de congelación / descongelación deben ser evitados.
TRANSPORTE:
genTaq Polimerasa debe ser transportada en hielo seco para mantener las condiciones de temperatura.
MEDIDAS DE SEGURIDAD:
genTaq es un reactivo de baja peligrosidad, no posee efectos adversos en mucosas, ni en la piel. Es indispensable el uso de los ele- mentos de bioseguridad.
UNIDAD DE DEFINICIÓN:
Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorpora cada 10nmol de dNTPs en 30 minutos a 72 °C.

 

Aplicaciones

 

La genTaq polimerasa ha sido ampliamente utilizada obteniendo los mejores resultados en pruebas como:

  • Filiación biológica y huella genética humana.
  • Inmunogenetica para la identificación del locus especifico del antígeno leucocitario humano (HLA).
  • Tambien han mostrado resultados satisfactorios en la amplificación
Otros Componentes

Buffer 10X tampón de reacción: El tampón de reacción contiene de KCl 500mM, y TRIS- HCl 100mM pH 9.0, la concentración de cada componente ha sido ampliamente optimizada. Esta demostrado que el KCl es un potencializador de la PCR siempre y cuando se encuentre en concentraciones adecuadas máximo de 50mM por reacción ya que con- centraciones mayores puede inhibir la misma.

MgCl2: De gran importancia para la PCR, ejerce la función de potenciar la reacción, su concentración ha sido ampliamente optimizada para el mejor rendimiento de la prueba, de acuerdo a los parámetros establecidos para la misma. Ayuda a la alineación y reconocimiento por parte de los Primers a la cadena de ADN

Protocolo de Uso

Recuerde: Las condiciones óptimas para la PCR varían, y son dependientes de los cebadores o primers usados en la reacción y de la calidad del ADN empleado.

RECOMENDACIONES:

  • Si adiciona colorante a la mezcla maestra recomen- dada, recuerde restar el volumen de colorante utilizado al volumen de AGUA indicado en la mezcla; a fin de mantener las concentraciones equimolares en la reacción.
  • Cuando siembre cada pozo o tubo de reacción adicione el 90% del volumen total por reacción indicado en la mezcla maestra para tener en cuenta el error de Pipeteo.
  • Si su muestra de ADN contiene trazas de EDTA u otros quelantes del ion Mg ++producto de su aislamiento, recomendamos aumentar la concentración de MgCl2 en reacción ya que los quelantes disminuyen el Mg +disponible para la reacción.
    protocolo-de-uso.

* la concentración de estos reactivos puede variar de acuerdo a la técnica empleada por los investigadores
**El colorante solo es necesario cuando se requiera evidenciar la amplificación del ADN por electroforesis ya que una de sus funciones es actuar como frente de corrida electroforético; para estos casos recomendamos usar rojo de cresol o rojo de fenol al 0.01% en reacción, si la electroforesis es vertical recomendamos Azul de bromofenol.
Si utiliza Real-Time PCR absténgase de usar colorantes ya que pueden inhibir las determinaciones del ADN amplifica- do.

Condiciones para PCR

Desnaturación inicial: El paso inicial de la denaturación se da a 96°C por 60 segundos no se recomienda para ADNs complejos como ADN plásmidico o ADNc. Para ADN eucariota la desnaturalización inicial se da hasta de 3 minutos con el fin de facilitar la fusión completa del ADN.

Denaturación: Se recomienda 5 ciclos de desnaturación a 96°C, la cual es adecuada para ADN ricos en GC. Para el bajo contenido de GC (40-45%) se recomienda disminuir 5 segundos el ciclo.

Anillamiento: La temperatura óptima depende de las secuencias de los primers y es generalmente 2-5°C por debajo de la Tm. Alternativamente se puede utilizar como punto de partida 55°C. Dependiendo de la reacción el tiempo de anillamiento también se puede reducir en 5 segundos el ciclo.

Extensión: El tiempo de extensión depende de la longitud del primer y la complejidad de ADN. Con un ADN de baja complejidad como el ADN plásmidico, un tiempo de extensión de 10 segundos es suficiente para un primer de 1kb o hasta 5kb. Para la amplificación de fragmentos de más de 1kb partir de un ADN de alta complejidad, tales como ADN genómico eucariótico, se recomienda incrementar el tiempo de extensión sucesivamente hasta 30s/ kb con el fin de encontrar más rápido la condición óptima para el primer.

Guía Solución de Problemas

Control de Esterilidad

Este es un producto que no requiere esterilidad, sin embargo se tiene la precaución de congelarlo a -20°C inmediatamente sale de producción para evitar que proliferen las bacterias que puedan haber quedado durante el proceso.

No obstante, durante el crecimiento de la bacteria sí se maneja estricta esterilidad, dado que ésta es una cepa K-12 de E. coli recombinante pura y debe evitarse a toda costa contaminación con otras bacterias dada su fragilidad, inducida mediante una alteración genética que asegura que la cepa solo puede crecer en presencia de ciertos nutrientes especiales que no están en el medio natural y que por lo tanto solo se pueden tener en el laboratorio. Una cepa K-12 modificada de este modo seria una bacteria segura, viable en el laboratorio pero inviable en el mundo exterior.

Control de Actividad

Vida media de la genTaq Polimerasa: esta enzima es termoestable, y esto se demuestra sometiéndola a
altas temperaturas. Está garantizada para resistir hasta 40 ciclos normales de PCR sin perder su actividad.

Ver el siguiente cuadro:

Ensayos

 

La genTaq polimerasa ha sido sometida a diferentes pruebas para la amplificación del ADN in-vitro, algunas de las cuales se presentan a continuación:

Ensayo 1:

La genTaq polimerasa amplificó correctamente ADN en estudios de investigación en hongos.

Ensayo 2:

Amplificación del ADN para determinar los polimorfismos del sistema HLA. Se ha probado en más de mil tipificaciones de HLA-A*B*C*DR*DQ* humano (HLA).

Ensayo 3:
Amplificación del ADN para la replicación de más de 5000 pruebas de paternidad responsable.

Técnica manual

Técnica capilar